聯(lián)系我們
- 地 址:廣東省深圳市南山區(qū)南頭街道中山東街33至34棟
- 電 話:13751058447,13751058616
- 傳 真:0755-8888999
- 郵 箱:{Lankecms_email}
實(shí)時定量PCR操作步驟, 方法,技巧,注意事項
一 :引物的設(shè)計
引物的設(shè)計對于這個實(shí)驗至關(guān)重要,因為 real time pcr 的檢測靈敏度比較高,所以相應(yīng)的對引物設(shè)計的要求就很高。普通的要求規(guī)則大家都知道,還有幾點(diǎn)必須注意:
1,引物的錯配率(引物錯配形成引物二聚體,但是 SYBR 照樣能嵌入進(jìn)去,結(jié)果導(dǎo)致實(shí)驗結(jié)果的誤差很大,重復(fù)性也不好)。
2,引物的特異性一定要高(不像常規(guī) PCR,引物同源性不高,只要兩條產(chǎn)物的片段長度相差足夠大,在電泳的時候能夠區(qū)分開就可以。real time PCR 只有在熔解曲線的時候能分開,所以這就造成整個實(shí)驗結(jié)果誤差很大,不可信)。
3,引物設(shè)計要跨內(nèi)含子,不能在一個外顯子上(我們的實(shí)驗是以 cDNA 為模板來擴(kuò)增的,如果有 DNA 污染的話,因為 DNA 上含有分子量很大的內(nèi)含子,不可能完成擴(kuò)增。這對我們消除整個實(shí)驗的誤差起很大的作用)。
4,引物設(shè)計的時候要盡可能設(shè)計在同一退火溫度,方便于以后同時擴(kuò)增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大,就得分開做,浪費(fèi)模板,浪費(fèi)管家基因,所以每個實(shí)驗室設(shè)計引物的時候要盡可能一致,這樣就不用每次查退火溫度,且對整個實(shí)驗有利。
5,注意引物設(shè)計好后的產(chǎn)物長度。REAL TIME PCR 的最佳產(chǎn)物長度在 150-250kb 左右(書上說這樣可以增加熒光的敏感度,減少實(shí)驗誤差,但是我對這個說法持懷疑態(tài)度。產(chǎn)物長度越大,SYBR 嵌入的越多,這樣才能夠保證最后的熒光值比較可信)。
6,不同的管家基因擴(kuò)增效率不同。所以在做整個實(shí)驗之前應(yīng)該做一次檢測擴(kuò)增效率的實(shí)驗。如果擴(kuò)增效率相差太大,就不能使用 delt,deltCt 法來比較基因表達(dá)量的高低。
二: 模板的要求
歸根到底,REAL TIME pcr 想要檢測的是目的基因表達(dá)量的高低,所以對整個實(shí)驗過程中模板的質(zhì)量要求必然很高,我以自己的一些經(jīng)驗說一下操作過程中的一些關(guān)鍵點(diǎn):
1,用 TRIZOL 提取 RNA 有范圍要求。細(xì)胞數(shù)必須在一個范圍之內(nèi)才能提取出高質(zhì)量的 RNA,所以我們在提取前必須知道細(xì)胞數(shù)(一般 6 孔板中兩個孔就可以提取出 RNA)。
2,加入氯仿抽提過程中盡可能不要吸到中間層(中間層為基因組 DNA,對上機(jī)做 REAL TIME PCR 很不利,會導(dǎo)致起始熒光值很高,無法跑出完整的擴(kuò)增曲線)。
3,提取完后用乙醇溶解要盡可能使得乙醇揮發(fā)掉,但是不要過分揮發(fā)。
注意:乙醇沒有揮發(fā)干凈會對后續(xù)的擴(kuò)增效率有影響。在乙醇存在的情況下,DNA 更加難溶,這就是醇沉的道理。但是過分揮發(fā),RNA 又不溶于水,會造成后續(xù)反轉(zhuǎn)錄量不高。
4,反轉(zhuǎn)錄過程的操作盡可能在冰上。
我們用的是 OLIGO DT18,為了盡可能的消除 RNA 之間的二聚體,我們將 RNA 和 OLIGO DT18 在一起 70 度變性 10 分鐘后,馬上冰浴 2 分鐘,再加入后續(xù)的 MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。然后在 37-40 度下一個小時完成延伸過程。
注意:也有的步驟上將 RNA 先 70 度變性 10 分鐘,再加入 OLIGO DT18 和 MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。但是在變性完再加 OLIGO DT18 時,加的比較晚的管子有很大的可能 RNA 又重新形成二聚體,導(dǎo)致前面的變性沒有意義。
5,反轉(zhuǎn)錄完后將 cDNA -20 度保存,盡可能不要反復(fù)凍融(可以以 10UL 為一個單位來分裝 cDNA)。
6,在加樣的過程中需要特別注意:
(1)最好引物和水做 MIX, 且配置完后需要放置在冰上,這樣可以消除不同管之間引物濃度的差異。
(2)最后加模板的時候需要一把很準(zhǔn)確的移液器,以便確保每次加進(jìn)去的樣一致,注意不要沾管壁。有條件的話可以加 ROX, 來消除不同的加樣體系來造成的誤差。
大部分人說需要混勻,但是我認(rèn)為只要確保加入到體系中就可以,不用刻意混勻。因為我們在反應(yīng)前有個 95 度變性,大家可以想象一下,在 95 度時候體系內(nèi)的分子運(yùn)動是很劇烈的,完全可以混勻。
(3)加樣完畢后最好離心一下,防止沾璧。
三: 上機(jī)操作
在做整個實(shí)驗之前,應(yīng)該對實(shí)驗有個整體的計劃,每個管中所加的物質(zhì)要有計劃。在程序上編好號碼,選好需要進(jìn)行的熔解曲線(因為機(jī)器剛開始是默認(rèn)為不進(jìn)行熔解曲線,切記)。
擴(kuò)增時,可以選擇兩步法(產(chǎn)物長度較小,退火和延伸都在 60 度完成),也可以選擇三步法(產(chǎn)物較大,只能分為 3 步,且應(yīng)該根據(jù)產(chǎn)物的長度來確定延伸時間,因為 TAQ 酶的延伸速度最少也在 50BP/S,因此可以換算出所需要的延伸時間)。
擴(kuò)增完畢后進(jìn)行熔解曲線,這個是必須要有的,因為這樣才能鑒定你產(chǎn)物的特異性和有無引物二聚體。如果前幾次做的話最好在做完 REAL TIME PCR 后將產(chǎn)物在 1% 的瓊脂糖凝膠上電泳,來確定自己的判斷。
四: 分析數(shù)據(jù)
用的比較多的是用雙 DELT 法相對定量,而絕對定量則必須要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備,需要對這個基因構(gòu)建質(zhì)粒,克隆分離。所以我們對基因表達(dá)量高低用雙 DELT 法(前提是擴(kuò)增效率要一致)。熔解曲線觀察,如果同一基因的熔解曲線不一樣,則造成結(jié)果不一致,重復(fù)性很差,因此要多摸條件,盡可能使熔解曲線一致。
實(shí)驗步驟:
1. 設(shè)計引物,溶解成為 10 mM 的濃度。
2. 提取 RNA,反轉(zhuǎn)錄成 CNDA
3. 常規(guī) PCR 以實(shí)驗所得模板擴(kuò)增看家基因 40 個循環(huán),電泳看產(chǎn)物多少。如果少,則不能進(jìn)行 REAL TIME PCR 操作。
4. 編寫好程序,加樣,上機(jī)
5. 分析結(jié)果
引物的設(shè)計對于這個實(shí)驗至關(guān)重要,因為 real time pcr 的檢測靈敏度比較高,所以相應(yīng)的對引物設(shè)計的要求就很高。普通的要求規(guī)則大家都知道,還有幾點(diǎn)必須注意:
1,引物的錯配率(引物錯配形成引物二聚體,但是 SYBR 照樣能嵌入進(jìn)去,結(jié)果導(dǎo)致實(shí)驗結(jié)果的誤差很大,重復(fù)性也不好)。
2,引物的特異性一定要高(不像常規(guī) PCR,引物同源性不高,只要兩條產(chǎn)物的片段長度相差足夠大,在電泳的時候能夠區(qū)分開就可以。real time PCR 只有在熔解曲線的時候能分開,所以這就造成整個實(shí)驗結(jié)果誤差很大,不可信)。
3,引物設(shè)計要跨內(nèi)含子,不能在一個外顯子上(我們的實(shí)驗是以 cDNA 為模板來擴(kuò)增的,如果有 DNA 污染的話,因為 DNA 上含有分子量很大的內(nèi)含子,不可能完成擴(kuò)增。這對我們消除整個實(shí)驗的誤差起很大的作用)。
4,引物設(shè)計的時候要盡可能設(shè)計在同一退火溫度,方便于以后同時擴(kuò)增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大,就得分開做,浪費(fèi)模板,浪費(fèi)管家基因,所以每個實(shí)驗室設(shè)計引物的時候要盡可能一致,這樣就不用每次查退火溫度,且對整個實(shí)驗有利。
5,注意引物設(shè)計好后的產(chǎn)物長度。REAL TIME PCR 的最佳產(chǎn)物長度在 150-250kb 左右(書上說這樣可以增加熒光的敏感度,減少實(shí)驗誤差,但是我對這個說法持懷疑態(tài)度。產(chǎn)物長度越大,SYBR 嵌入的越多,這樣才能夠保證最后的熒光值比較可信)。
6,不同的管家基因擴(kuò)增效率不同。所以在做整個實(shí)驗之前應(yīng)該做一次檢測擴(kuò)增效率的實(shí)驗。如果擴(kuò)增效率相差太大,就不能使用 delt,deltCt 法來比較基因表達(dá)量的高低。
二: 模板的要求
歸根到底,REAL TIME pcr 想要檢測的是目的基因表達(dá)量的高低,所以對整個實(shí)驗過程中模板的質(zhì)量要求必然很高,我以自己的一些經(jīng)驗說一下操作過程中的一些關(guān)鍵點(diǎn):
1,用 TRIZOL 提取 RNA 有范圍要求。細(xì)胞數(shù)必須在一個范圍之內(nèi)才能提取出高質(zhì)量的 RNA,所以我們在提取前必須知道細(xì)胞數(shù)(一般 6 孔板中兩個孔就可以提取出 RNA)。
2,加入氯仿抽提過程中盡可能不要吸到中間層(中間層為基因組 DNA,對上機(jī)做 REAL TIME PCR 很不利,會導(dǎo)致起始熒光值很高,無法跑出完整的擴(kuò)增曲線)。
3,提取完后用乙醇溶解要盡可能使得乙醇揮發(fā)掉,但是不要過分揮發(fā)。
注意:乙醇沒有揮發(fā)干凈會對后續(xù)的擴(kuò)增效率有影響。在乙醇存在的情況下,DNA 更加難溶,這就是醇沉的道理。但是過分揮發(fā),RNA 又不溶于水,會造成后續(xù)反轉(zhuǎn)錄量不高。
4,反轉(zhuǎn)錄過程的操作盡可能在冰上。
我們用的是 OLIGO DT18,為了盡可能的消除 RNA 之間的二聚體,我們將 RNA 和 OLIGO DT18 在一起 70 度變性 10 分鐘后,馬上冰浴 2 分鐘,再加入后續(xù)的 MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。然后在 37-40 度下一個小時完成延伸過程。
注意:也有的步驟上將 RNA 先 70 度變性 10 分鐘,再加入 OLIGO DT18 和 MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。但是在變性完再加 OLIGO DT18 時,加的比較晚的管子有很大的可能 RNA 又重新形成二聚體,導(dǎo)致前面的變性沒有意義。
5,反轉(zhuǎn)錄完后將 cDNA -20 度保存,盡可能不要反復(fù)凍融(可以以 10UL 為一個單位來分裝 cDNA)。
6,在加樣的過程中需要特別注意:
(1)最好引物和水做 MIX, 且配置完后需要放置在冰上,這樣可以消除不同管之間引物濃度的差異。
(2)最后加模板的時候需要一把很準(zhǔn)確的移液器,以便確保每次加進(jìn)去的樣一致,注意不要沾管壁。有條件的話可以加 ROX, 來消除不同的加樣體系來造成的誤差。
大部分人說需要混勻,但是我認(rèn)為只要確保加入到體系中就可以,不用刻意混勻。因為我們在反應(yīng)前有個 95 度變性,大家可以想象一下,在 95 度時候體系內(nèi)的分子運(yùn)動是很劇烈的,完全可以混勻。
(3)加樣完畢后最好離心一下,防止沾璧。
三: 上機(jī)操作
在做整個實(shí)驗之前,應(yīng)該對實(shí)驗有個整體的計劃,每個管中所加的物質(zhì)要有計劃。在程序上編好號碼,選好需要進(jìn)行的熔解曲線(因為機(jī)器剛開始是默認(rèn)為不進(jìn)行熔解曲線,切記)。
擴(kuò)增時,可以選擇兩步法(產(chǎn)物長度較小,退火和延伸都在 60 度完成),也可以選擇三步法(產(chǎn)物較大,只能分為 3 步,且應(yīng)該根據(jù)產(chǎn)物的長度來確定延伸時間,因為 TAQ 酶的延伸速度最少也在 50BP/S,因此可以換算出所需要的延伸時間)。
擴(kuò)增完畢后進(jìn)行熔解曲線,這個是必須要有的,因為這樣才能鑒定你產(chǎn)物的特異性和有無引物二聚體。如果前幾次做的話最好在做完 REAL TIME PCR 后將產(chǎn)物在 1% 的瓊脂糖凝膠上電泳,來確定自己的判斷。
四: 分析數(shù)據(jù)
用的比較多的是用雙 DELT 法相對定量,而絕對定量則必須要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備,需要對這個基因構(gòu)建質(zhì)粒,克隆分離。所以我們對基因表達(dá)量高低用雙 DELT 法(前提是擴(kuò)增效率要一致)。熔解曲線觀察,如果同一基因的熔解曲線不一樣,則造成結(jié)果不一致,重復(fù)性很差,因此要多摸條件,盡可能使熔解曲線一致。
實(shí)驗步驟:
1. 設(shè)計引物,溶解成為 10 mM 的濃度。
2. 提取 RNA,反轉(zhuǎn)錄成 CNDA
3. 常規(guī) PCR 以實(shí)驗所得模板擴(kuò)增看家基因 40 個循環(huán),電泳看產(chǎn)物多少。如果少,則不能進(jìn)行 REAL TIME PCR 操作。
4. 編寫好程序,加樣,上機(jī)
5. 分析結(jié)果